4月22日，上?？萍即髮W聯(lián)合中國科學院上海藥物研究所、清華大學、中國科學院武漢病毒研究所和重慶醫(yī)科大學等多家單位在《自然》(Nature)上共同發(fā)表了題為“Substrate recognition and cleavage mechanism of the monkeypox protease, Core protease”的最新研究成果。聯(lián)合攻關團隊首次證實天花病毒、猴痘病毒等正痘病毒屬的核心蛋白酶(Core Protease，CorePro)是一個全新的廣譜抗病毒藥物靶標;解析了猴痘病毒核心蛋白酶的高分辨率三維空間結構，揭示了其識別底物的分子機制;在此基礎上，研究團隊成功設計了多個具有強效廣譜抗病毒活性的小分子抑制劑并闡明其精確作用機制。該系統(tǒng)性研究為廣譜抗正痘病毒(如猴痘病毒)藥物的開發(fā)奠定了重要基礎。上?？萍即髮W為第一完成單位。

　　正痘病毒屬包含天花病毒、猴痘病毒等重要的人類病毒，它們是一類有包膜的雙鏈DNA病毒。天花病毒引發(fā)的天花曾經是人類歷史上極具毀滅性的傳染病之一，據(jù)不完全統(tǒng)計，曾導致數(shù)億人死亡。猴痘病毒(mpox virus, MPXV)于1958年首次在實驗猴群中被分離鑒定，1970年報道了首例人感染病例。猴痘病毒感染后的典型癥狀包括高熱、持續(xù)性頭痛、特征性淋巴結腫大以及漸進性皮膚損傷等，嚴重時可引發(fā)腦炎、敗血癥、永久性視力喪失甚至死亡。2022年5月非流行區(qū)爆發(fā)疫情以來，猴痘病毒確診病例數(shù)呈指數(shù)級增長。世界衛(wèi)生組織(WHO)分別于2022年7月23日和2024年8月15日兩次啟動最高級別警報，將猴痘疫情列為"國際關注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件"(PHEIC)。截至最新統(tǒng)計，131個國家和地區(qū)累計報告超過13.4萬例實驗室確診病例，其中死亡291例。目前針對猴痘病毒感染的預防和治療手段非常有限。因此，發(fā)現(xiàn)和確證抗正痘病毒的新型藥物靶點，以及開發(fā)強效抗病毒抑制劑，對當前猴痘疫情的有效控制具有現(xiàn)實緊迫性，同時為應對其他正痘病毒的威脅提供保障。

　　正痘病毒屬的成員都編碼一種高度保守的核心蛋白酶(在痘苗病毒和猴痘病毒中稱為I7，在天花病毒中稱為K7)，這種蛋白酶對于病毒成熟和感染性子代病毒的產生至關重要。核心蛋白酶能夠精準識別Ala-Gly-Xaa序列并在甘氨酸(Gly)位點酰胺鍵位置進行切割，驅動病毒粒子從不具有感染性的未成熟病毒形態(tài)(IV)轉變?yōu)榫哂懈腥拘缘某墒觳《拘螒B(tài)(IMV)。核心蛋白酶的突變或缺失會導致病毒失去感染能力，提示猴痘病毒核心蛋白酶是一個潛在的抗病毒藥物開發(fā)靶標。

　　研究團隊成功表達并純化了具有活性的猴痘病毒核心蛋白酶，結合單顆粒冷凍電鏡和X射線晶體衍射技術，解析了其高分辨率的三維結構(圖1)。核心蛋白酶呈現(xiàn)出二體的組裝模式，每個單體包括N端結構域(N-terminal domain, NTD)，催化結構域(catalytic domain, CD)和C端結構域(C-terminal domain, CTD)?；钚灾行奈挥诖呋Y構域，包含一個催化三聯(lián)體Cys328-His241-Asp258。猴痘病毒核心蛋白酶的二體相互作用模式與其他重要人類病毒的蛋白酶不同，是核心蛋白酶結構穩(wěn)定和發(fā)揮催化功能的關鍵。

圖1 猴痘病毒核心蛋白酶的整體結構、催化結構域特征及二聚化模式

　　為了開發(fā)潛在的靶向猴痘病毒核心蛋白酶的抑制劑，研究團隊首先采用高通量篩選的方法，發(fā)現(xiàn)一種用于治療肌肉萎縮的廣譜半胱氨酸蛋白酶抑制劑aloxistatin (E64d)對其催化活性具有較好的抑制效果，同時也表現(xiàn)出一定的抗痘苗病毒及抗猴痘病毒活性，表明aloxistatin能夠作為開發(fā)抗痘病毒藥物的苗頭化合物。團隊隨后解析了猴痘病毒核心蛋白酶與aloxistatin復合物的結構，發(fā)現(xiàn)aloxistatin與活性中心附近一個非催化的Cys237殘基形成共價鍵，但未能完全占據(jù)底物結合口袋，這可能是其抑制活性不強原因。

　　因此，為了開發(fā)更強效的新型靶向抑制劑，研究團隊開展了病毒核心蛋白酶底物識別和催化機制的研究。研究人員以核心蛋白酶一種天然底物P25K的序列為基礎，設計了一段C末端醛基取代的底物類似物I-G18。I-G18能夠與核心蛋白酶的催化中心的Cys328共價結合，模擬催化中間態(tài)的結構特征。研究團隊通過冷凍電鏡技術，解析了這一復合物的三維結構(圖2)。發(fā)現(xiàn)在底物的誘導下，核心蛋白酶活性中心發(fā)生一系列構象變化，在S1和S2位形成特征的狹長口袋，僅可容納P1位Gly和P2位Ala這兩個側鏈極短的氨基酸，解釋了核心蛋白酶對底物中這兩個位置氨基酸的高度選擇性。

圖2 猴痘病毒核心蛋白酶的底物識別機制

　　以核心蛋白酶的底物識別機制為基礎，研究團隊設計合成了一系列擬肽類抑制劑，其中A3-A6具有高效的病毒核心蛋白酶抑制活性(IC50范圍：44.9 nM～100.3 nM)，且表現(xiàn)出較強的抗猴痘病毒活性(EC50范圍：1.98 μM～7.31 μM)和抗痘苗病毒活性(EC50范圍：1.39 μM～3.66 μM)，同時具有良好的安全性(CC50大于200 μM)。研究人員解析了抑制劑A3與核心蛋白酶的復合物結構，他們發(fā)現(xiàn)A3不僅可以與蛋白酶的催化中心的Cys328形成共價鍵，還可以利用其化學修飾基團同底物結合口袋的氨基酸殘基形成額外的氫鍵相互作用，以增強其結合能力。這些研究結果表明了化合物A3-A6在后續(xù)開發(fā)廣譜抗痘病毒抑制劑上的具有巨大潛力，是良好的先導化合物。

圖3 靶向抑制劑的設計策略與構效關系(a抗猴痘病毒核心蛋白酶活性;b抗痘苗病毒復制活性;c抗猴痘病毒復制活性)

　　本研究工作是抗痘病毒藥物研究領域的重大突破，首次明確了核心蛋白酶的組裝模式及底物識別機制，并基于該發(fā)現(xiàn)成功設計并篩選出一系列新型擬肽類化合物，這些化合物不僅表現(xiàn)出優(yōu)異的酶活抑制效果，更展現(xiàn)出顯著的廣譜抗痘病毒活性。這些研究成果一方面為當前猴痘病毒的防治提供了全新的科學依據(jù)和潛在治療手段，另一方面為應對未來可能由正痘病毒屬引發(fā)的公共衛(wèi)生安全威脅儲備了前瞻性解決方案，具有廣闊的應用前景。

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　　https://www.nature.com/articles/s41586-025-09014-x